Al momento di questa progressione, 41 precursori dello stato inclusi nell’algoritmo di pianificazione e 10 della scansione PASEF MS / MS, in totale.
Questo [peptide + GlcNAc + H] + è sempre il frame finale della catena di scissione dei glicani degli spettri della ionica trappola, che generalmente produce spettri con [peptide + GlcNAc + H] + o [peptide + H] + mangia il cornicione finale della catena, la seconda dimensione del peptide e della frazione glicanica e nella distribuzione della carne affumicata c’è la molecularola.
Nonostante il fatto che la classificazione in ProteinScape passi attraverso un parametro specifico per affrontare il problema, la massa N-glicopeptidica di base sull’abbondanza e la calcolata maschio tornano, perché l’identificazione va male.
Per fornire una soluzione al problema, è l’unica condizione che corrisponde alla struttura del linguaggio N-glicopeptide utilizzando Glu strumenti oTOF di Bruker.
Hinneburg et al.1,2 nell’uso della sintesi dell’N-glicopeptide e del sonno definitivo, compreso il parametro energetico CID, in modo da fornire la maggior quantità possibile dal peptide glicanico al peptide. semplice aspettativa tandem di SM.
La Figura 1C mostra l’energia di collisione ideale. L’applicazione del rischio in un metodo di acquisizione coerente rispetto al gesto di attivazione, l’uso di un passaggio costoso alla fine del tempo di energia di collisione e l’impostazione del trasferimento (Figura 1A e B).
Nel caso del framing N-glicopeptidico, l’energia del frame di collisione, necessario per il framing del framing peptidico, determina il modello del framing caratteristico, nonché lo stato della descrizione da parte del framing MALDI3.
In questione, (0.2) X-ring frammentazione della N-acetylglucosamina più internal of the chitobiose nucleus (+83 Da), e una perdita della porzione complete N-glycan per scissione sia of the N-glycosidico legame che del Il gruppo ammidico La parete laterale dell’N-glicosilato produce un caratteristico doppietto del picco con una massa diversa di 17 di.
Figura 2. Spettro DIC tipico dell’ictuto glicopeptide utilizzando il metodo Glycopeptide Instant Expertise ™.
La Figura 2 mostra una caratteristica CID N-glicopeptide CID, miscelata con il metodo di acquisizione Instant Expertise ™. Ingrandisci la parete sud dell’inquadratura delle menzionate in precedenza.
Il puntatore di ProteinScape consente la classificazione dei glycopeptidi framingi MALDI, il software viene fornito in bundle con un fluo di lavoro di classificazione integrato basato sui frammenti caratteristici visti nella Figura 2 e delineati sopra (-17 Da], + 83 giorni, +20 giorni).
Inoltre, qualunque sia il gusto utilizzato a causa dell’inquadratura, esiste un ulteriore trattamento tipico dell’N-glicopeptide e la risposta automatica alla classificazione automatica 3 del glicopeptide).dietonus componenti La Figura 4 mostra un esempio di un N-glicopeptide classificato (nuovo sapore) e identificazione (da GlycoQuest e Mascot).
Figura 3. ProteinScape: Classificazione del “pattern MALDI”.
Figura 4. ProteinScape: spettro CID annotato glicopeptide.
Conclusioni
perché ciò è dovuto all’installazione del framework CID, come descritto da Hinneburg et al.1,2, combinato con una classe di mirato in ProteinScape.
Tutta la struttura della struttura dell’N-glicopeptide, la quantità di massa peptidica fuorviata in modo irregolare è radicalmente ridicola, con l’identificazione dell’N-glicopeptide estremamente affettiva.
Riferimenti
- Hinneburg H, Stavenhagen K, Schweiger-Hufnagel U, Pengelley S, Jabs W, Seeberger PH, Silva DV, Wuhrer M, Kolarich D. The Art of Destruction: Optimizing Collision Energies in Quadrupole-Time of Flight (Q-TOF) Strumenti per Glicoproteomicina a base di glicopeptide. J Am Soc Mass Spectrom. 2016 marzo; 27 (3): 507-19.
- Nota poster PN-03: Uso di energia di collisione multipla per la migrazione del glicopeptide N e O attraverso LC-MS / MS. Hinneburg H, Kolarich D, Schweiger-Hufnagel U, Pengelley S; Bruker Daltonik GmbH, Brema, Germania.
- Wuhrer M, Hokke CH, Deelder AM. L’analizzatore di glicopeptidi mediante il laser di assorbimento / ionizzazione assiste nella spettrometria la matrice della massa tandem contemporaneamente in un nuovo carattere della glicosylazione del rafano perossidasi. Velocità di comunicazione di massa. 2004; 18 (15): 1741-8.
- Nota applicativa n LCMS-66: analisi diretta dell’N-glicopeptide che combina la rapida acquisizione della trappola ionica con la nuova funzionalizzazione di ProteinScape. Neue K, Kiehne A, Meyer M, Macht M, Schweiger-Hufnagel U, Resemann A, Bruker Daltonik GmbH, Brema, Germania
A proposito di Bruker Daltonics
Nuove modalità Scopri per applicare la spettrometria di massa quanto necessario per analizzare le urgenti dell’oggi. Innovazioni com Trapped Ion Mobility (TIMS), smartbeam e laser di scansione por l’imaging MALDI-MS che rappresentano una vera fedeltà dei pixel e la tecnologia eXtreme Resolution FTMS (XR) in grad di livelare l’azienda Isotopic Fine Structure (IFS) stanno spingendo l’esplorazione scientifica nuovi livelli. La soluzione di spettrometria di massa consente a tutte le informazioni nelle scienze e alle informazioni e alle informazioni.
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“https://www.news-medical.net/whitepaper/20190315/PASEF-Redefining-New-Standards-for-Proteomics-Research.aspx”,”200″,”OK”, “Contenuto sponsorizzato inserito il 15 marzo 2019
La separazione multidimensionale è essenziale per fornire una visione accurata e dettagliata del contenuto del prototipo nella sua interezza nonché della quantità e qualità del prodotto e del suo utilizzo nel dispositivo commerciale.
In tempi recenti questa lanciata lanciata intrapolata ion mobility spettrometria (TIMS) and abbinata a gli spettrometri di pasta QTOF. In TIMS, gli ioni sono guidati through TIMS tunnel returns gas flusso. Un campo elettrico coglie l’origine nella colonia vertebrale vendita del flusso di gas corrispondente all’intensità del campo elettrico, permette la separazione per mobilitazione, carattere in fase gassosa e una funzione tridimensionale della dimensione della carta (Figura 1).
Figura 1. Modalità operativa TIMS: con forza diretta del flusso di gas, es. Campo elettrico, E, accumulato e intrapolati sulla base della mobilità. La graduale accessibilità del campo elettrico derivata dalla seriale eluizione di ioni separati, vengon transferring the QTOF. Utilizzando la modalità dell’accumulo per secondo, la seconda parte del dispositivo TIMS proviene dalla seconda parte del dispositivo TIMS, tra le successive serie di lingue arriva nella parte successiva del dispositivo TIMS.
Quando il campo elettrico viene ridotto, gli ioni selettivi vengono rilasciati dal tunnel TIMS in base alla mobilità ionica (Ω / z), dove si trova la sezione trasversale collisionale (CCS) dello ione. Contrariamente a tutta la separazione convenzionale del tubo di deriva per dimensione, iniziale gli ioni più grandi eluiscon, successiva decrescente gli ioni sezione trasversale. A tal proposito, questione di poco rilievo per lo strumento timsTOF Pro (Bruker Daltonics), con successive analisi della spettrometria di massa nel tempo del quadrupolo (Figura 2).
Figura 2. L’ottica ionica dello strumento timsTOF Pro che include un doppio analizzatore TIMS e uno spettrometro di massa QTOF.
Gli spettri prodotti ai tempi del ciclo TIMS ciclo sonno chiamato scansione TIMS. La separazione bidimensionale dello ione (m / ze 1 / K0) – somma in una scansione TIMS – perché questa è una mappa termica TIMS MS, con m / z e mobilità mangiano ripetitivamente xey (vedi Figura 3).
Figura 3. Illustrazione delle mappe termiche TIMS MS (sinistra) e PASEF MS / MS (destra) risultanti dalle separazioni TIMS. Sebbene i dati generati possano essere molto complessi, la mobilizzazione ionica del precursore mirati e l’inquadratura della carta che facilita l’allineamento dei dati. Se ho notato il precursore di questa m / z (giallo e verde) posso dire che è abbastanza separati dalla pappagallo mobilità.
Tutto questo, ho specificato che questo è un isolamento in tre dimensioni basato sul tempo di eluizione TIMS, il tempo di cromatografia liquida (LC) in / z (in questo caso, in un quadrupolo) e anche la dissociazione separata della collisione. In questa mappa termica PASEF MS / MS generato, è possibile allinearsi e inquadrare con il precursore della carta nella mappa termale TIMS MS poiché è verificata alla stessa mobilità ionica (Figura 3).
La separazione di quella separazione ortogonale o fuori dalla vista della valutazione del complimento della proteomica, la sua utilità per l’identificazione del peptide è essenziale nel discutere in vari modi la causa della sensibilità della sensibilità dell’individuo all’individuo , inoltre, la velocità di scansione elevata dovevano è compatibile con i normali tempi di scansione TIMS di 100 ms. Implementando la tecnica del proprio strumento QTOF tramite scansione rapida, è possibile strappare velocemente il quadro ionico del precursore ionico della qualità spettrale.
Utilizzando un analizzatore dopp TIMS, lo ione ionico arriva quasi continuamente, si accumula e si muove attraverso la mobilizzazione, un ciclo del 100% vicino lavoro (Figura 1). Il quadrupolo cambia la sua posizione di isolamento (di massa) e ritorna durante il periodo della scansione IMS, l’ippodromo della MS / MS del precursore diversi (vedi Figura 4).
Figura 4. Illustrazione del metodo PASEF mostrato nella modalità operativa standard TIMS MS / MS, con una scala di 100 ms. Usando PASEF (pannello inferiore), il quadrupolo cambia la posizione dell’isolamento per il giro successivo durante la scansione di mobilizzazione ionica, con il precursore che viene isolato e successivamente trasferisce tutta la cellula alla collisione. Al contrario, con l’omologazione standard del TIMS MS / MS (pannello superiore), si arriva da un unico precursore alla scansione TIMS.
Inoltre, a causa del precursore del basso, potrebbe essere tanto a causa dell’aumento del numero e dell’aumento del numero di identificazione del peptide. Applicato alla separazione della mobilizzazione ionica dalla MS / MS se si traduce in rapporti segnale-rumore migliorati, perché la specie ionica mirata è focalizzata al momento e trasferisce successivamente tutta la cellula a terra durante il periodo di tempo nel suo dispositivo TIMS. Tuttavia, la causa di questa ulteriore dimensione di separazione, se il sacerdote distingue il precursore dal coelentente st / m della LC, è impossibile con la sola base della selezione di massa.
Acquisizione di precursori dipendenti dai dati bidimensionali (m / z-Mobility)
Il tempo necessario per determinare e precursore che saranno scelti da MS / MS è un’alternativa nella rapida acquisizione della data. Massimizzare il numero degli MS / MS della qualità, passaggio necessario per la buona riuscita del successo proteomico, ricchezza di intensità e risoluzioni degli ioni relativi, viene aumentata l’ultima delle quali (aumentando il numero di precursori) la seconda dimensione della separazione. Obiettivi di minore intensità possiedono questi framementati più tornati con la capacità di acquisire la velocità a velocità elevata. Ciò significa che un metodo algoritmico rispetto a velocità e semplicità [3] pianificherà efficacemente il successivo inquadramento dell’inquadratura all’inizio dell’inizio dell’inizio del momento nell’ambito della MS nella dimensione della mobilitazione in / z. Il tempo di calcolo non supera 1 millisecondo nel campo della proteomica estremamente complementare, supportando facilmente la raccolta dati ad vecchie prestazioni.
Superimentary
Una miscellanina dal derivato peptidico trittico dà alla cellula tutta diluita con acido formico (FA) tutto lo 0,1% in acqua fine ad una concentrazione di 200 ng / µl. Lo spettrometro di massa timsTOF Pro è collegato a un nanoElute UHPLC (Bruker Daltonics). La miscela di peptidi (200 ng) viene trasferita in un colon C18 (25 cm X 75 µm X 1,6 µm, IonOpticks, Australia). La separazione cromatografica sinistra e destra utilizzando un gradiente lineare dal 2% al 37% di tampone B (0,1% FA in ACN) e una velocità di flusso di 400 nL / minuto per 90 minuti. Successivamente, ho datato MS sono stati raci su un intervallo MS / MS da 100 a 1700 e un intervallo m / z da 100 a 1700. Durante la racecta di dati MS / MS, il ciclo TIMS era da 1,1 secondi e contiene 1 MS + un supporto da 10 scansioni PASEF MS / MS. I dati, so ottenuti, sono stati sottoposti al motore di ricerca MASCOT for l’identificazione dei peptidi.
Raccolta rapida dei dati….
Come previsto per il tipo di campione, il cromatogramma della base picco (BPC) (vedi Figura 5, in alternanza) indica uno spettro altamente spettrale della specie peptidica. La potenza della tecnica PASEF è facilmente visibile, considerando un lungo intervallo del tempo del gradiente LC (61,7 minuti).
Al momento di questa progressione, 41 precursori dello stato inclusi nell’algoritmo di pianificazione e 10 della scansione PASEF MS / MS, in totale. Valorizzando una mappa termica TIMS dell’eluizione (a tempo) (vedi Figura 5, anche quella sinistra), il cambio rapido dell’isolamento del quadrupolo per i primi 12 precursori diventa ovvia. I precursor extra sleep mirati nei segmenti successivi del gradiente di eluizione. La figura 5 (destra e destra) indica tutti e precursori valutati tutti interni alla domanda del ciclo PASEF, compreso il sequenziamento della parte inferiore. Questo statuto equivale a 119 eventi separati MS / MS (è corso da PASEF utilizzando il suo spettrometro di massa timsTOF) tutto all’interno del singolo ciclo PASEF (1,1 secondi).
Figura 5. Analizza LC MS / MS, HeLa digest fornisce 200 ng, 90 min di gradiente. A: Cromatogramma della base picco. B: Heatmap TIMS MS a 61,7 min, con precursori mirati indicati. Infatti il sinistro, primo evento di PASEF MS / MS, precursore cerchiati in arancione. In questo caso, completare il ciclo PASEF MS / MS, con la stessa linea di colore indicata e target per un segmento TIMS. I precursori più abbondanti sono stati sequenziati nei cicli di scansione precedenti e sono stati esclusi dinamicamente dal ri-sequenziamento.
… Scopo necessario per aumentare la consapevolezza
La caratteristica della significativa sufficienza proteomica nel terreno da sola ha tutta l’intensità della base del campo completo, che non è necessaria ai fini della strategia della lente MS / MS più. La figura 6 mostra la potenzialità della separazione (attratte diverse dalla mobilità ionica) e la sensibilità del metodo PASEF.
Figura 6. Raccolta di precursori a m / z 887.96, 888.94 e 889.78 che indica una mappa termica TIMS MS, con il numero dei sommati MS / MS per ciascuno indicato. Nella parte inferiore della mappa termica è il cromatogramma del picco della base con cui è l’interleaving del m / z ristretto.
Gli spettri MS / MS sommati da tre precursori a bassa intensità di m / z analoghi nella regione dense spettro sono stati facilmente ravevati con valor di aspettativa bassi (probabilità uma corrispondenza casuale), great copplication of sequenza and punteggio elevato MASC. Ovviamente, le prestazioni del sonno QTOF (successivo) sono cruciali per lo spettrometro di massa timsTOF Pro è fuori dall’isotopo superiore della federazione (TIP ™ il True Isotopic Pattern), ha bisogno di massa in ppm e alto rischio. Il vantaggio del metodo integrato per l’applicazione della proteomica per facilitare tutto lo sfarzo è mostrato dalla maggiore sicurezza delle identità dei peptidi (vedi Figura 8). In questo campione (HeLa digestion dà 200 ng, elemento LC con un gradiente di 90 minuti), dormi staticamente quasi il doppio del peptide utilizzando il metodo PASEF rispetto all’analisi senza separazione spettrometrica di intrapolata ion mobilità (utilizzando l’intrapolato struzionezionzionica intrapzionica strezionezionica Dispositivo TIMS spento).
